研究テーマ

1.　ユビキチン分解による細胞周期制御機構とその破綻による癌病態の解明（工藤）

2.　口腔癌の浸潤・転移に関わる新規因子の同定とその機能（工藤、毛利、山本）

3.　多能性幹細胞の未分化能維持機構（工藤）

4.　歯原性上皮細胞分化制御機構の解明（工藤）

5.　エネルギー代謝関連酵素であるアデニル酸キナーゼ・アイソザイムの機能と生理的意義の解析（堀口）

6.　膵β細胞における細胞機能維持機構の解明と疾患関連性の解析（水澤）

7.　唾液腺細胞株を用いたマイクロRNAの機能解析（水澤）

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1. ユビキチン分解による細胞周期制御機構とその破綻による癌病態の解明

ユビキチン–プロテアソーム経路によるタンパク質分解は、生命活動のさまざまな場面で重要な役割を担っている。近年、タンパク質分解におけるユビキチン化の異常が、癌や神経変性疾患をはじめとする多くの疾患に関与することが明らかになりつつある。そのため、ユビキチンに関する研究は飛躍的に発展しており、タンパク質にユビキチンを連結させる酵素であるユビキチンリガーゼの分子的実体も明らかになってきた。

タンパク質のユビキチン化は、ユビキチン活性化酵素（E1）、ユビキチン結合酵素（E2）、ユビキチンリガーゼ（E3）によって進行する。ユビキチンはATP依存的に標的タンパク質のリジン残基にイソペプチド結合し、このE1–E2–E3のカスケード反応が繰り返されることでポリユビキチン鎖が形成される。ポリユビキチン化されたタンパク質は、26Sプロテアソームによって分解される。この機構において、特にE3ユビキチンリガーゼは標的タンパク質の認識に重要な役割を果たす。哺乳類では、E1が3種類、E2が約65種類であるのに対し、E3は1,000種類を超えるとされている。

一つの細胞が二つの娘細胞を生み出す一連の過程である細胞周期の制御異常は、癌の発生における必須のイベントである。これまでに細胞周期調節因子の発現異常に関する多くの研究が行われてきたが、それらの異常が生じる分子機構の多くは、いまだ十分には解明されていない。細胞周期調節因子の多くは、ユビキチン化を介したタンパク質分解により厳密に制御され、細胞周期の円滑な進行を支えている。しかし、この制御機構の破綻と癌化との関連については、なお未解明な点が多い。

細胞周期制御に関わる代表的なユビキチンリガーゼとして、SCF（Skp1–Cullin–F-box）複合体およびAPC/C（anaphase-promoting complex/cyclosome）複合体が知られている。SCF複合体は、Skp1、Cul1、F-boxタンパク質、Roc1から構成される。なかでもF-boxタンパク質は基質認識を担い、哺乳類では69種類が存在するとされる。一方、APC/Cは多数のサブユニットからなる大型のユビキチンリガーゼ複合体であり、時期特異的なユビキチン化を担うアダプター因子Cdc20やCdh1の可逆的な結合、ならびに構成サブユニットのリン酸化によって活性が調節されている。APC/C-Cdc20は分裂前期から前中期にかけて活性化し、分裂後期から終期にかけてAPC/C-Cdh1が活性化する。APC/C-Cdh1の活性はG1/S期移行期まで持続し、その後、APC/C阻害因子であるEmi1によって抑制される。APC/C-Cdc20はM期の紡錘体チェックポイント制御に中心的な役割を果たし、APC/C-Cdh1は細胞分裂関連因子をG1期に分解することで、細胞周期の一方向性を維持している。

我々はこれまで、SCF複合体およびAPC/C複合体による細胞周期調節因子のユビキチン分解制御機構と、その異常による癌化に着目し、以下の研究を行ってきた。

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体細胞における細胞周期制御とその異常

1）SCF-βTrCP1によるEmi1のユビキチン分解

Pagano研究室への留学中、F-boxタンパク質の一つであるβ-TrCP1（FBXW1A）に着目して研究を行った。当時、β-TrCP1はIκBαやβ-cateninのユビキチン分解に関与することが知られていた。β-TrCP1ノックアウト（KO）マウスを作製し、その表現型を解析したところ、明らかな異常は認められなかった。これは、β-TrCP1のホモログであるβ-TrCP2（FBXW11）が、IκBαやβ-cateninの分解制御を代償しているためと考えられた。

一方で、唯一の明らかな表現型として、β-TrCP1 KO雄マウスに不妊傾向がみられ、精祖細胞の分裂異常により精子形成が障害されていることを見出した。詳細な解析により、細胞分裂制御に関わるEmi1（FBXO5）を新規基質タンパク質として同定した（Dev Cell 4:799–812, 2003）。Emi1はAPC/Cユビキチンリガーゼの活性を抑制する因子であり、M期初期にSCF-βTrCPによってEmi1がユビキチン分解されることで、APC/Cが活性化されることを明らかにした。

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2）APC/C-Cdh1によるAurora-Aタンパク質のユビキチン分解機構

Aurora-Aは、分裂期チェックポイント因子として時間的・空間的にダイナミックに局在を変化させながら、さまざまな基質タンパク質をリン酸化し、M期への進行、中心体の分離、紡錘体形成、染色体分離、細胞質分裂などを制御している。Aurora-Aタンパク質はS期からM期にかけて発現し、G1期にはAPC/C-Cdh1ユビキチンリガーゼによりユビキチン分解される。

我々は、ヒトAurora-Aタンパク質がAPC/C-Cdh1によりユビキチン分解されることを初めて報告した（PLoS ONE 2, 2007）。さらに、M期にAurora-Aタンパク質の51番目のセリン残基（Ser51）がリン酸化されることで、APC/C-Cdh1によるユビキチン分解を回避し、安定化することを明らかにした。

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3）M期におけるAPC/C-Cdh1によるGemininのユビキチン分解制御機構

APC/C-Cdh1の基質タンパク質として知られるGemininは、1回の細胞周期においてDNA複製を1回に制限する重要な因子である。GemininはS–G2期において、複製前複合体（pre-replication complex; pre-RC）の形成に必須なCDT1に直接結合し、CDT1のクロマチン結合を阻害することでDNAの再複製を抑制する。その後、GemininはG1期にAPC/C-Cdh1によりユビキチン分解される。このため、APC/C活性の高いM期終期からG1期にかけてのみpre-RC形成が可能となる。

我々は、GemininがM期にAurora-AによってThr25をリン酸化されることで、APC/C-Cdh1による分解を回避し、安定化することを見出した。さらに、安定化したGemininは、SCF-Skp2を介したCDT1のユビキチン分解を抑制し、CDT1を安定化させることで、M期終期からG1期におけるpre-RC形成を適切に誘導し、次のS期でのDNA複製を保証することを明らかにした（Nat Commun 4:1885, 2013）。

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4）APC/C-Cdh1によるBorealinのユビキチン分解制御機構

染色体パッセンジャー複合体は、活性の中心であるAurora-Bキナーゼ、その活性を制御すると考えられるSurvivinおよびBorealin、さらに複合体の足場として働くINCENPの4つのタンパク質から構成される。染色体パッセンジャー複合体は、Aurora-Bによる基質タンパク質のリン酸化を介して、正確な染色体分配を制御する重要な因子である。

我々は、Borealinタンパク質がG1期にAPC/C-Cdh1によりユビキチン分解され、それにより染色体パッセンジャー複合体の機能が終結することを見出した。APC/C-Cdh1は通常、RxxLやKENといった分解配列を認識して基質をユビキチン化するが、Borealinは典型的な分解配列ではなく、特異的な配列を介して認識されることを明らかにした（J Cell Sci 133(18), 2020）。

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5）Cyclin FによるRRM2のユビキチン分解を介したDNA修復機構

Pagano教授との共同研究により、DNA複製と修復に必要なリボヌクレオチドのdNTPへの変換を触媒するリボヌクレオチドリダクターゼRRM2が、G2期にCyclin F（FBXO1）によってユビキチン分解され、dNTP量とゲノム安定性の維持に関与することを明らかにした（Cell 149:1023–1034, 2012）。さらに、DNA損傷時にはCyclin Fの発現低下によりRRM2タンパク質が安定化し、dNTP量が調節されることで効率的なDNA修復が促進されることを示した。

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6）SCF-βTrCPによるCDC25Bのユビキチン分解を介したストレス応答機構

金沢大学・山下准教授との共同研究により、MAPキナーゼ経路を活性化する細胞ストレスが、G2/M期進行に関わるフォスファターゼCDC25Bをリン酸化し、SCF-βTrCPによるユビキチン分解を誘導することで、G2期停止を引き起こすことを見出した（J Cell Sci 124:2816–2825, 2011）。

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7）癌におけるSCF-Skp2によるp27Kip1の分解

癌におけるp27Kip1の発現低下には、過剰なユビキチン分解が関与することが明らかになっている。我々は、プロテアソーム阻害剤の投与によるp27Kip1の分解抑制や、非分解型p27Kip1の遺伝子導入が癌細胞にアポトーシスを誘導することを明らかにした（Clin Cancer Res 6:916–923, 2000; Oncology 63:398–404, 2002）。

p27Kip1タンパク質は、G1期からS期へ進行する際に、F-boxタンパク質であるSkp2（FBXL1）によりユビキチン化される。また、Skp2のp27Kip1への結合には、アクセサリータンパク質であるCks1が必要であることが報告されている（Nat Cell Biol 1:193–199, 1999; Nat Cell Biol 3:321–324, 2001）。我々は、口腔癌症例および培養細胞株において、Skp2およびCks1が高頻度に過剰発現し、p27Kip1の発現低下や予後不良と相関することを見出した（Cancer Res 61:7044–7047, 2001; Am J Pathol 165:2147–2155, 2004）。また、癌細胞におけるsiRNAによるSkp2のノックダウンが、p27Kip1の分解抑制を介して増殖を抑制することを明らかにした（Mol Cancer Ther 4:471–476, 2005）。

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8）乳癌におけるSCF-βTrCP1による発癌機構

β-TrCP1は乳癌症例において高頻度に過剰発現が認められることから、乳腺特異的に発現するMMTVプロモーターを用いてβ-TrCP1トランスジェニック（TG）マウスを作製した。その結果、β-TrCP1 TGマウスでは、IκBαのユビキチン分解を介した恒常的なNF-κB活性化により、乳腺の導管形成が促進され、乳癌が発症することを見出した（Mol Cell Biol 24:8184–8194, 2004）。

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9）Aurora-Aタンパク質のユビキチン分解異常による癌化機構

ヒトAurora-A遺伝子であるAURKA/STK15は20q13.2に位置し、多くの癌で遺伝子増幅およびmRNA過剰発現が報告されている。Aurora-Aキナーゼ阻害剤は、新規抗癌剤として臨床応用が進められている。

我々は、癌におけるAurora-Aタンパク質の過剰発現が、従来その原因と考えられてきた遺伝子増幅やmRNA過剰発現のみでは説明できないことを見出した（PLoS ONE 2, 2007; Mol Carcinog 48:810–820, 2009; Front Oncol 5:187, 2015）。Aurora-AのSer51が恒常的にリン酸化されている癌細胞では、遺伝子増幅やmRNA過剰発現を示す癌細胞に比べて、ユビキチン分解の阻害により、より強いAurora-Aタンパク質の蓄積が引き起こされることを見出し、新たなAurora-A過剰発現機構を提唱した。

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10）Emi1ノックダウンによるDNA再複製の誘導と癌治療への応用

APC/Cの活性を阻害するEmi1のノックダウンは、APC/Cの活性化を介してGemininタンパク質の分解を促進し、DNA再複製による増殖停止を引き起こすことが報告されている（Genes Dev 21:184–194, 2007; J Cell Biol 177:425–437, 2007）。我々は、Emi1が口腔癌を含む多くの癌で過剰発現していることを見出した。さらに、種々の癌細胞において、Emi1 siRNAによる発現低下がAPC/C-Cdh1の活性化を介してDNA再複製を誘導し、細胞増殖を抑制することを明らかにした（J Biol Chem 288:17238–17252, 2013）。加えて、Emi1ノックダウンが、DNA複製を標的とする抗癌剤や放射線照射の抗癌効果を増強することを示した。

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多能性幹細胞におけるユビキチン分解制御

1）SCF-Fbxo15によるミトコンドリア生合成調節機構

ニューヨーク大学Pagano教授との共同研究により、マウスES細胞において、ミトコンドリア関連キネシンKif1Bαの結合因子であるKBPタンパク質が、アセチル化を介してFbxo15によりユビキチン分解されることを見出した（Nat Cell Biol 19:341–351, 2017）。マウスES細胞では、KBPタンパク質がユビキチン分解されることでミトコンドリアの蓄積が制限され、細胞の最適な適応性が維持される。一方、分化細胞ではKBPは分解を受けずに蓄積し、ミトコンドリア生合成を促進することを明らかにした。

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2）BorealinによるAurora-Bキナーゼ活性を介した未分化能維持機構

胚性幹細胞では、細胞周期を通じてEmi1が安定化することにより、APC/C活性が低く維持されていることが報告されている（PNAS 108:19252–19257, 2011; Nat Commun 7:10660, 2016）。我々は、細胞分裂に重要な役割を果たす染色体パッセンジャー複合体の構成因子の一つであるBorealinタンパク質が、体細胞においてAPC/C-Cdh1によりユビキチン分解されることを見出した。

さらに、胚性幹細胞ではBorealinタンパク質が細胞周期を通じて安定化しており、レチノイン酸による分化誘導過程でAPC/C-Cdh1によりユビキチン分解されることを明らかにした。また、胚性幹細胞におけるBorealinのノックダウンは、未分化マーカーの発現低下と分化マーカーの発現亢進を誘導し、この現象はAurora-Bキナーゼ活性の低下によるものであることを示した。実際に、Aurora-Bキナーゼ阻害剤の投与によっても同様の変化が認められた。これらの結果から、多能性幹細胞においてBorealinは、Aurora-Bキナーゼ活性を介して未分化能の維持に重要な役割を果たすことを明らかにした（Sci Signal 18, Issue 874, 2025）。現在、多能性幹細胞の維持に関わるAPC/C-Cdh1基質タンパク質の探索を進めている。

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3）RNF32によるNF-κBシグナル制御を介した腸上皮幹細胞恒常性維持機構

NF-κBシグナル伝達経路は、感染防御や炎症応答を制御する生体に必須のシグナル伝達系であり、その異常は炎症性腸疾患や癌などさまざまな疾患の発症に関与する。しかしながら、腸上皮幹細胞においてNF-κBシグナルがどのように制御されているかについては、ほとんど明らかにされていなかった。

我々は、腸上皮幹細胞に特異的に高発現するE3ユビキチンリガーゼRNF32に着目し、その生理的機能を解析した。その結果、RNF32はカルシウム依存的に活性化され、自身のユビキチン化を介してIκBキナーゼ（IKK）複合体の構成因子であるNEMOと結合し、NF-κBシグナルを活性化することを明らかにした。さらに、RNF32欠損マウスではNF-κB活性が著しく低下し、腸上皮幹細胞の分化異常が生じることを見出した。特に、パネート細胞の減少と杯細胞の増加を伴う腸上皮恒常性の破綻が認められ、RNF32が腸幹細胞ニッチの維持に重要な役割を果たすことを明らかにした。

また、RNF32は液-液相分離（liquid-liquid phase separation）を介してIKK複合体の活性化を促進し、NF-κBシグナルの効率的な伝達を担うことを見出した。これらの結果から、RNF32は腸上皮幹細胞におけるNF-κBシグナル制御の中核因子であり、組織恒常性維持に不可欠であることが明らかとなった（Mol Cell 85: 2025）。

本研究で明らかにしたRNF32によるNF-κB制御機構は、炎症性腸疾患や大腸癌の病態理解に新たな知見を提供するとともに、将来的にはこれら疾患に対する新規治療標的の開発につながることが期待される。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

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2. 口腔癌の浸潤・転移に関わる新規因子の同定とその機能解析

近年、口腔癌の発生率は増加傾向にある。口腔癌に対する標準的治療としては外科的切除が広く行われているが、審美的・機能的、さらには心理的な損失が大きく、患者のQOL低下が大きな課題となっている。そのため、外科的切除に依存しない治療法として、すでに臨床応用されている免疫療法や超選択的動注化学療法に加え、癌の発生・進展に関わる遺伝子や分子を標的とした、より特異的な治療法の開発が求められている。その実現には、癌の発生や進展を制御する分子メカニズムの解明が不可欠である。

通常、粘膜表層に発生した口腔癌細胞は、周囲組織の深部へ浸潤し、頸部リンパ節や遠隔臓器へと転移していく。深部浸潤や転移の有無は、患者の予後を左右する最も重要な因子であることから、浸潤・転移機構の解明は、口腔癌制御における極めて重要な課題である。我々は、口腔癌の浸潤・転移機構を明らかにし、その悪性度診断ならびに新規治療法の開発へ応用することを目的として研究を進めてきた。

これまでに、口腔癌患者の頸部リンパ節転移巣より高浸潤能を有する細胞株を樹立し（Oral Oncol, 2003）、さらにin vitro invasion assayを応用して高浸潤能を有するクローンを分離した。その解析により、これらの高浸潤能クローンでは、E-cadherinのメチル化および細胞膜に存在するβ-cateninの分解により、細胞間接着が低下し、高浸潤能を獲得していることを報告した（Clin Cancer Res, 2004）。さらに、マイクロアレイを用いて親株と高浸潤能細胞の遺伝子発現プロファイルを比較し、浸潤に関わる複数の候補遺伝子を同定した。

候補遺伝子のうち、最も発現差が大きかったPeriostinについては、in vitroおよびin vivoの解析により、口腔癌の浸潤・転移に深く関与することを明らかにした。また、in vivoで広範な浸潤を伴う転移を引き起こすことを示すとともに、癌に特異的なスプライシングバリアントを同定した（Cancer Med 12:8510–8525, 2023; Cancer Res, 2006; Br J Cancer, 2006）。さらに、2番目に発現差が大きかったInterferon-induced transmembrane protein 1（IFITM1）についても、口腔癌の初期浸潤に関与することを明らかにした（Clin Cancer Res, 2008）。

そのほか、Wnt5B、MMP-10、MMP-13などを口腔癌の浸潤に関わる新規因子として同定し、これらの因子の浸潤への関与をin vitroで詳細に解析した。さらに、口腔癌の手術材料やパラフィン包埋切片を用いて、これらの因子の臨床病理学的意義を明らかにした（PLoS ONE, 2011; PLoS ONE, 2012; J Biol Chem, 2012; Oncotarget, 2016）。我々が同定した口腔癌浸潤関連因子の中には、他の悪性腫瘍の浸潤・転移やEMTに関与するものも含まれており、現在までに、我々の研究成果を支持する多くの報告がなされている。

また、近年の研究により、口腔癌の進展には完全なEMTよりも、部分的なEMT、すなわちpartial-EMTがより深く関与することを示してきた（Sci Rep 14:6767, 2024; Cancer Med 12:8510–8525, 2023; J Oral Biosci 64:176–182, 2022; Sci Rep 11:14943, 2021; Int J Mol Sci 21:6207, 2020; Oral Dis 26:1149–1156, 2020）。Partial-EMTは、口腔癌の悪性度を規定する重要な細胞状態であり、浸潤・転移、治療抵抗性、腫瘍微小環境との相互作用に関わる中心的な概念として注目されている。これらの因子は、癌の予後を予測する有用なマーカーであるだけでなく、新たな治療標的となることが期待される。最近では、臨床情報を有するHNSCC症例の公開遺伝子発現データやシングルセル解析データを活用し、partial-EMTを中心とした口腔癌悪性化機構の解明に取り組んでいる。

 

 

 

 

 

 

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